氣相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用很廣泛，其方法建立與驗(yàn)證對(duì)藥物分析而言是非常重要的，今天小集就和大家聊一聊如何進(jìn)行氣相色譜的方法建立與方法驗(yàn)證。

氣相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用包括藥物的定性、含量測(cè)定、雜質(zhì)檢查(有關(guān)物質(zhì)檢查)、農(nóng)藥殘留、殘留溶劑及微量水分測(cè)定、藥物中間體的監(jiān)控(反應(yīng)程度的監(jiān)控、合成路線的優(yōu)化)、中藥成分研究、制劑分析、體內(nèi)藥物分析及臨床診斷等方面。

其方法建立的一般步驟為首先確定樣品預(yù)處理方法；然后優(yōu)化分離條件，直到達(dá)到滿意的分離結(jié)果；最后建立數(shù)據(jù)處理的方法，包括定性鑒定和定量測(cè)定。根據(jù)不同的目的，對(duì)建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

01.樣品的來(lái)源和預(yù)處理方法

 GC（氣相色譜儀）能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無(wú)機(jī)鹽），可能會(huì)損壞色譜柱的組分。

針對(duì)一個(gè)未知樣品時(shí)，根據(jù)其來(lái)源與可能含有的組分，確定樣品的沸點(diǎn)范圍。如能確定直接進(jìn)樣分析，只要找一種合適的溶劑即可，如丙酮、己烷、三氯甲烷、苯等都是GC常用的溶劑。使用毛細(xì)管GC分析時(shí)，應(yīng)注意樣品濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品濃度為mg/ml級(jí)或更低。

如果樣品中有不能用GC直接分析的組分或樣品濃度太低，就必須進(jìn)行必要的預(yù)處理，包括采用一些預(yù)分離手段，如各種萃取技術(shù)、濃縮方法、提純方法等。

02.確定儀器配置

所謂儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進(jìn)樣裝置、什么載氣、什么色譜柱以及什么檢測(cè)器。

一般應(yīng)首先確定檢測(cè)器類型。碳?xì)浠衔锍＿x擇FID檢測(cè)器，含電負(fù)性基團(tuán)（F、Cl等）較多且碳?xì)浜枯^少的物質(zhì)易選擇ECD檢測(cè)器；對(duì)檢測(cè)靈敏度要求不高，或含有非碳?xì)浠衔锝M分時(shí)，可選擇TCD檢測(cè)器；對(duì)于含硫、磷的樣品可選擇FPD檢測(cè)器。

對(duì)于液體樣品可選擇隔膜墊進(jìn)樣方式，氣體樣品可采用六通閥或吸附熱解析進(jìn)樣方法，一般色譜僅配置隔膜墊進(jìn)樣方式，所以氣體樣品可采用吸附-溶劑解析-隔膜墊進(jìn)樣的方式進(jìn)行分析。

根據(jù)待測(cè)組分性質(zhì)選擇適合的色譜柱，一般遵循相似相容規(guī)律。分離非極性物質(zhì)時(shí)選擇非極性色譜柱，分離極性物質(zhì)時(shí)選擇極性色譜柱。色譜柱確定后，根據(jù)樣本中待測(cè)組分的分配系數(shù)的差值情況，確定色譜柱工作溫度，簡(jiǎn)單體系采用等溫方式，分配系數(shù)相差較大的復(fù)雜體系采用程序升溫方式進(jìn)行分析。

常用的載氣有氫氣、氮?dú)?、氦氣等。氫氣、氦氣的分子量較小常作為填充柱色譜的載氣；氮?dú)獾姆肿恿枯^大，常作為毛細(xì)管氣相色譜的載氣；氣相色譜質(zhì)譜用氦氣作為載氣。

03.確定初始操作條件

 當(dāng)樣品準(zhǔn)備好，且儀器配置確定之后，就可開始進(jìn)行嘗試性分離。這時(shí)要確定初始分離條件，主要包括進(jìn)樣量、進(jìn)樣口溫度、檢測(cè)器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進(jìn)樣量要根據(jù)樣品濃度、色譜柱容量和檢測(cè)器靈敏度來(lái)確定。

樣品濃度不超過(guò)10mg/mL時(shí)填充柱的進(jìn)樣量通常為1-5uL，而對(duì)于毛細(xì)管柱，若分流比為50：1時(shí)，進(jìn)樣量一般不超過(guò)2uL。進(jìn)樣口溫度主要由樣品的沸點(diǎn)范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進(jìn)樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點(diǎn)最高的組分的沸點(diǎn)，但要低于易分解溫度。

04.分離條件優(yōu)化

分離條件優(yōu)化目的就是要在最短的分析時(shí)間內(nèi)達(dá)到符合要求的分離結(jié)果。在改變柱溫和載氣流速也達(dá)不到基線分離的目的時(shí)，就應(yīng)更換更長(zhǎng)的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因?yàn)樵?/span>GC中，色譜柱是分離成敗的關(guān)鍵。

05.定性分析

所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對(duì)于簡(jiǎn)單的樣品，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照來(lái)定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品，根據(jù)保留值即可確定色譜圖上哪個(gè)峰是要分析的組分。定性時(shí)必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對(duì)未知樣品的定性僅僅用一個(gè)保留數(shù)據(jù)是不夠的，雙柱或多柱保留指數(shù)定性是GC中較為可靠的方法，因?yàn)椴煌幕衔镌诓煌纳V柱上具有相同保留值的幾率要小得多。條件允許時(shí)可采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)定性。

被測(cè)物組分定性分析方法包括：

利用保留時(shí)間定性；

利用加入純物質(zhì)增加峰高法定性；

利用相對(duì)保留值定性；

利用碳數(shù)/沸點(diǎn)規(guī)律定性；

利用保留指數(shù)定性；

利用雙柱或多柱定性；

利用檢測(cè)器定性；

與其它方法結(jié)合定性。

06.定量分析

要確定用什么定量方法來(lái)測(cè)定待測(cè)組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法最簡(jiǎn)單，但最不準(zhǔn)確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時(shí)該法才是可選擇的。

峰面積（峰高）百分比法是根據(jù)檢測(cè)器對(duì)待測(cè)物的響應(yīng)（峰高或峰面積）與待測(cè)物的量成正比的原理進(jìn)行定量的。因此必須準(zhǔn)確測(cè)定峰高h或峰面積A。

定量依據(jù)：

注:Mi– I組分的量；fi– I組分的校正因子；Ai–I組分的峰面積

1．峰面積A的測(cè)量

對(duì)稱峰：峰高h與半峰寬的積即

A=1.065×h×W1/2

不對(duì)稱峰：峰高與平均峰寬的積即

A=1/2×h×（W1/2+ W085）

自動(dòng)求和（自動(dòng)積分儀或色譜工作站）

直接給出A,H,W1/2

2. 定量校正因子

定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與響應(yīng)信號(hào)成正比，但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)也不同，直接用響應(yīng)信號(hào)定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子，在計(jì)算組分的量時(shí)，必須將峰面積A進(jìn)行“校正”。

（1）絕對(duì)校正因子

wi=fi’Ai

式中wi為組分I的量，它可以是質(zhì)量，也可以是摩爾或體積（對(duì)氣體）；Ai為峰面積，f為換算系數(shù)，稱為定量校正因子。

定量校正因子定義為：?jiǎn)挝环迕娣e的組分的量。檢測(cè)器靈敏度Si與定量校正因子有以下關(guān)系式：

fi’=1/Si

（2）相對(duì)校正因子fi

由于絕對(duì)校正因子fi與檢測(cè)器靈敏度有關(guān)，它即不易準(zhǔn)確測(cè)得（因?yàn)槲镔|(zhì)量Wi不易準(zhǔn)確測(cè)量），因此定量分析中常用相對(duì)校正因子表示fi，即用一個(gè)物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)，用相對(duì)校正因子將所有待測(cè)物的峰面積校正成相對(duì)于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，使各組分的峰面積與其質(zhì)量的關(guān)系有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行折算。

歸一化法的前提是，試樣中所有組分產(chǎn)生信號(hào)并能檢出色譜峰。依據(jù)組分含量與峰面積成正比。此方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，定量結(jié)果與進(jìn)樣量、重復(fù)性無(wú)關(guān)；色譜條件略有變化對(duì)結(jié)果幾乎無(wú)影響。缺點(diǎn)是所有組分必須在一定時(shí)間內(nèi)都出峰，必須已知所有組分的校正因子，不適合微量組分的測(cè)定。

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）以Ai對(duì)xi標(biāo)準(zhǔn)曲線。該法不需校正因子。但進(jìn)樣量和操作條件必須嚴(yán)格控制外標(biāo)法適用日常分析和大批量同類樣品分析。

內(nèi)標(biāo)法在配制的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中以及待測(cè)試樣中加一固定量為ms的內(nèi)標(biāo)物，以Ai/As對(duì)xi作圖，得內(nèi)標(biāo)法校正曲線（以抵消實(shí)驗(yàn)條件和進(jìn)樣量變化）。對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求是：樣品中不含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；峰的位置在各待測(cè)組分之間或與之相近；穩(wěn)定、易得純品；與樣品能互溶但無(wú)化學(xué)反應(yīng)；內(nèi)標(biāo)物濃度恰當(dāng)，使其峰面積與待測(cè)組分相差不太大。

07.方法的驗(yàn)證

所謂的方法驗(yàn)證，就是要證明所開發(fā)方法的實(shí)用性和可靠性。實(shí)用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購(gòu)得，樣品處理方法是否簡(jiǎn)單易操作，分析時(shí)間是否合理，分析成本是否可被同行接受等?？煽啃詣t包括定量的線性范圍、檢測(cè)限、方法回收率、重復(fù)性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度等。

下面就簡(jiǎn)單討論其中幾個(gè)可靠性參數(shù)：

1、方法的線性范圍

即檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品量(濃度)成正比的線性范圍，它主要由檢測(cè)器的特性所決定。原則上。這一線性范圍應(yīng)覆蓋樣品組分濃度整個(gè)變化范圍。線性范圍的確定通常是采用一系列(多于3個(gè))不同濃度的樣品進(jìn)行分析，以峰面積(或峰高)對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于0．99時(shí)，就可認(rèn)為足線性的，小于0．99時(shí)，就超出了線性范圍。一個(gè)好的GC定量方法，其線性范圍(以FID檢測(cè)器為例)可達(dá)10；，線性相關(guān)系數(shù)等于或大于0．9999。

2、方法的檢測(cè)限

檢測(cè)限(DL)是指方法可檢測(cè)到的最小樣品量(濃度)。一般的原則是按照3倍信噪比計(jì)算，即氣樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時(shí)，該樣品的濃度就被作為最小檢測(cè)限，與此對(duì)應(yīng)的該組分的進(jìn)樣量就叫做最小檢測(cè)量-此外。憶驗(yàn)證定量方法時(shí)，還將10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的樣品濃度叫做最小定量限，當(dāng)用于法規(guī)分析時(shí)，這一數(shù)據(jù)應(yīng)等于或低于法規(guī)方法所要求的實(shí)際樣品中待測(cè)組分的最低允許濃度。

檢測(cè)限的測(cè)定可用一個(gè)接近檢測(cè)限濃度的樣品進(jìn)行分析，據(jù)所得色譜峰的峰高來(lái)計(jì)算。設(shè)此時(shí)濃度為c、相應(yīng)的峰高為h(信號(hào)強(qiáng)度單位)、基線噪聲為N(與h的單位相同)，則檢測(cè)限可按下面公式計(jì)算：

c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h

噪聲的大小與儀器的性能，特別是檢測(cè)器及其電子電路的穩(wěn)定性直接相關(guān)，也與載氣的純度、色譜柱的性能及操作條件有關(guān)。噪聲的測(cè)定是在正常操作條件下，儀器穩(wěn)定時(shí)，將信號(hào)放大(降低衰減或放大縱坐標(biāo))來(lái)測(cè)量，一般是測(cè)定樣品出峰前后1min的基線噪聲。

作為分析方法，檢測(cè)限無(wú)疑是越低越好。為此，應(yīng)選擇靈敏度高的檢測(cè)器，使用高純度的載氣和輔助氣，同時(shí)要定期維護(hù)儀器，保持進(jìn)樣口和檢測(cè)器的清潔，保持色譜柱的性能。此外，仔細(xì)優(yōu)化分離條件、適當(dāng)加大進(jìn)樣量(如采用大體積進(jìn)樣技術(shù))也是降低檢測(cè)限的常用方法。

3、方法回收率

即方法測(cè)得的樣品組分濃度與原來(lái)樣品中實(shí)有濃度的比率。如果樣品未經(jīng)任何預(yù)處理，則回收率一般可不考慮。只有當(dāng)某些樣品組分被儀器系統(tǒng)不可逆吸附時(shí)，回收率才是需要考慮的問(wèn)題。如果樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個(gè)方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。

回收率可用下述簡(jiǎn)單方法測(cè)定：配置一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其兩等分，其中一份按方法步驟進(jìn)行預(yù)處理，然后用GC分析。另一份則不經(jīng)頸處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測(cè)組分峰面積的比率乘以100即是該組分的回收率。有時(shí)實(shí)際樣品很復(fù)雜，特別是樣品基質(zhì)對(duì)預(yù)處理的回收率影響較大時(shí)，就必須用空白樣品基質(zhì)(確信不含待測(cè)物)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，比如測(cè)定廢水中有機(jī)農(nóng)藥殘留量時(shí)，就要采用不含農(nóng)藥的水作空白基質(zhì)，在其中加入已知量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行處理和分析。處理后測(cè)得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很顯然，回收率太低時(shí)會(huì)影響方法的檢測(cè)限。當(dāng)樣品處理過(guò)程較復(fù)雜時(shí)，應(yīng)分步測(cè)定回收率，最后針對(duì)回收率最低的步驟進(jìn)行方法改進(jìn)，以期提高整個(gè)方法的回收率。

4、方法重復(fù)性和重現(xiàn)性

重現(xiàn)性是指同一方法在不同時(shí)間、地點(diǎn)、不同型號(hào)儀器、不同操作人員使用寸所得結(jié)果的一致性。與此近似的另一個(gè)術(shù)語(yǔ)是重復(fù)性，常指同一個(gè)人在同一臺(tái)儀器上重復(fù)進(jìn)樣所得結(jié)果的一致性。事實(shí)上，二者常常混用，多數(shù)人不做嚴(yán)格區(qū)分。但大多數(shù)歐洲學(xué)者會(huì)嚴(yán)格區(qū)分二者的不同。我們認(rèn)為對(duì)現(xiàn)代儀器來(lái)說(shuō)，分析重復(fù)性是容易實(shí)現(xiàn)的，而重現(xiàn)性則是更重要的，也是方法驗(yàn)證所必須考察的。重現(xiàn)性和重復(fù)性都用多次分析所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)表示。

方法的重現(xiàn)性應(yīng)包括多次連續(xù)進(jìn)樣分析的重復(fù)性、不同時(shí)間(天與天之間)分析的重復(fù)性、不同型號(hào)儀器之間的重現(xiàn)性和不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。作為方法開發(fā)人員，首先應(yīng)測(cè)定重復(fù)性，即在相同條件下連續(xù)進(jìn)樣5—10次，統(tǒng)汁待測(cè)組分的保留時(shí)間和峰面積(或峰高)的RSD，一般要求保留時(shí)間的RSD不大于1％，峰面積的RSD不大于5%。文獻(xiàn)報(bào)道的最佳重復(fù)性數(shù)據(jù)為保留時(shí)間的RSD小于0.1%，峰面積的RSD小于1%。

如果樣品要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，還應(yīng)測(cè)定同一樣品多次處理的重復(fù)性。即同一樣品取3—5份做平行處理，看最后測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。這一RSD值應(yīng)不大于5％。當(dāng)然，有些工業(yè)分析要求不大于10％即可。至于天與天之間的重現(xiàn)性也不應(yīng)大于10%。

當(dāng)上述重復(fù)性滿足要求后，說(shuō)明該方法在你的實(shí)驗(yàn)室是可靠的。要將此方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法推廣使用，還必須測(cè)定不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。當(dāng)這些重現(xiàn)性(RSD)都能滿足要求時(shí)。這一方法的可靠性就得到了較為滿意的驗(yàn)證。

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