高效液相色譜法方法開發(fā)技巧之找到目標(biāo)峰

在液相色譜方法開發(fā)的過程中，一個(gè)總的原則是：先找到目標(biāo)峰，然后調(diào)整峰形和分離，再進(jìn)一步完善。

找到目標(biāo)峰，如果是已知目標(biāo)化合物，可通過標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行確定。如果是未知復(fù)雜樣品，則需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)的目的和樣品本身來進(jìn)行判斷。在不了解樣品信息的情況下，通常最好選擇C18柱作為初始的選擇。因?yàn)?/span>C18柱使用最多，手頭上一般都會有現(xiàn)成的柱子可嘗試，而且C18的保留機(jī)理也最為簡單，我們對它的保留性能最了解和最熟悉的，通過樣品在C18柱上的獲得的信息，我們可以預(yù)測其極性等性質(zhì)，方便調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法。

找到目標(biāo)峰說起來很簡單，實(shí)際上在實(shí)驗(yàn)過程中還是經(jīng)常會碰到很多的問題，例如，峰沒有

1.
峰沒有保留
在碰到峰沒有保留這種情況的時(shí)候，首先可以先調(diào)整一下流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，降低流動(dòng)相的洗脫能力，下表列出了在各種色譜模式下，如何改變?nèi)軇┑南疵撃芰?，可參照這個(gè)表格進(jìn)行調(diào)整。

下圖為一個(gè)通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相洗脫能力，增強(qiáng)化合物保留的例子。隨著流動(dòng)相中乙腈比例的降低，目標(biāo)化合物的保留隨之增強(qiáng)，且達(dá)到基線分離的效果。

如果調(diào)整了流動(dòng)相洗脫能力之后保留還是沒有改善，則可以通過改變流動(dòng)相條件或者更換其他的固定相或者對樣品進(jìn)行衍生化處理等進(jìn)行調(diào)整。

例如對于酸性或堿性化合物，改變流動(dòng)相的pH值，使得目標(biāo)化合物在流動(dòng)相中呈中性狀態(tài)，可以增加目標(biāo)化合物的保留；還可以在流動(dòng)相中添加相應(yīng)的離子對試劑，以增強(qiáng)保留。另外還可以考慮更換固定相，如換成具有極性選擇性的高碳載量的反相C18柱；或采用離子交換或者HILIC模式進(jìn)行分離。

對于中性化合物，則更多需要考慮更換固定相，如具有極性選擇性的高碳載量的反相C18柱；或者選擇HILIC模式或正相分離的模式進(jìn)行分離。

對于兩性化合物，如氨基酸之類的樣品，還可以考慮對樣品進(jìn)行衍生化處理，以增強(qiáng)在固定相上的保留。

2.
沒有出峰

在碰到樣品沒有出峰的情況，首先考慮是否是因進(jìn)樣濃度太小，運(yùn)行時(shí)間不夠，儀器和色譜柱故障，樣品是否降解變質(zhì)，檢測器（檢測波長）的選擇是否準(zhǔn)確等問題導(dǎo)致的。如果排除上述問題，樣品仍未出峰，則很有可能是樣品在固定相上保留太強(qiáng)，這樣可以先調(diào)整流動(dòng)相的洗脫能力，增強(qiáng)對化合物的洗脫，或者更換更合適的固定相，如反相C18換成碳載量低一些的C18或者短碳鏈的反相柱如C8等。

3.
有其他雜峰干擾

如果碰到有其他峰干擾的情況，可以先做一個(gè)空白實(shí)驗(yàn)，排除試劑、色譜柱和儀器系統(tǒng)污染或梯度變化等導(dǎo)致的空白雜峰的干擾。（TIPs：空白實(shí)驗(yàn)應(yīng)該如何做呢？除不加樣品之外，采用完全相同的樣品處理、分析步驟、試劑和用量，進(jìn)行平行操作。在這里建議大家在做完空白實(shí)驗(yàn)之后，再進(jìn)幾針樣品來做進(jìn)一步判斷。）排除空白干擾之后，如果還無法判斷目標(biāo)峰的位置，對于已知化合物，通?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)品來確定出峰的位置；對于未知樣品的復(fù)雜樣品，可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模紤]樣品是否需要制備純化，再通過其他分析鑒定對樣品中各組分進(jìn)行其他定性定量分析（如紅外，質(zhì)譜，核磁等）。

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