高效液相色譜儀常用檢測器及其性能

液相色譜檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號，常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。

1、紫外吸收檢測器

紫外吸收(UV)檢測器是目前HPLC應(yīng)用最廣泛的檢測器。其工作原理是朗伯-比爾定律。這種檢測器靈敏度高，線性范圍寬，對流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫分離。紫外吸收檢測要求被檢測樣品組分有紫外-可見光吸收，而使用的流動相無吸收，或在被測組分吸收波長處無吸收。一般選擇在欲分析物有最大吸收的波長處進(jìn)行檢測，以獲得最大靈敏度和抗干擾能力。在沒有最大吸收時，可采用末端吸收。檢測波長的選擇除取決于待測物質(zhì)的成分和分子結(jié)構(gòu)外，還必須考慮流動相組成、共存組分干擾等因素。特別是各種溶劑都有一定的透過波長下限值，超過這個波長，溶劑的吸收會變得很強，以至于不能很好地測出待測物質(zhì)的吸收強度。下表列出了HPLC中一些常用的溶劑透過波長的下限。

2、光電二極管陣列檢測器

光電二極管陣列檢測器（photodiode array detector，PDAD）又稱快速掃描紫外可見分光度計，是一種新型的光吸收檢測器。它采用光電二極管陣列作為檢測元件，形成多通道并行工作,同時它對光柵分離的所有波長的光信號進(jìn)行檢測，然后將其入射到陣列接收機，然后快速掃描二極管陣列來采集數(shù)據(jù),得到吸收值(A)是保留時間(tR)和波長(L)函數(shù)的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)，從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長。計算機化的數(shù)據(jù)處理，還可進(jìn)行色譜峰光譜相似性比較、峰純度檢測及利用譜圖庫對樣品進(jìn)行檢索等，為定性、定量分析提供更豐富的信息。

單光束二極管陣列檢測器，光源發(fā)出的光先通過檢測池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長的光在接收器上同時被檢測。陣列式接收器上的光信號用電子學(xué)的方法快速掃描提取出來，每幅圖像僅需要10 ms，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。

3、熒光檢測器

熒光檢測器（fluorescence detector， FD）是一種高靈敏度、有選擇性的檢測器，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。熒光檢測器的原理與熒光分析法相同，化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光或發(fā)射光。許多藥物和生命活性物質(zhì)具有天然熒光,能直接檢測，某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，然后進(jìn)行熒光檢測。其最小檢測濃度可達(dá)0.1 ng／mL，適用于痕量分析。一般情況下，熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約高2個數(shù)量級，但其線性范圍不如紫外檢測器寬。近年來，采用激光作為熒光檢測器的光源而產(chǎn)生的激光誘導(dǎo)熒光檢測器極大地增強了熒光檢測的信噪比，因而具有很高的靈敏度，在痕量和超痕量分析中得到廣泛應(yīng)用。

4、示差折光檢測器

示差折光檢測器（differential refractive Index detector， RID）是一種通用的濃度檢測器，對所有溶質(zhì)都有響應(yīng)。某些不能用選擇性檢測器檢測的組分，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測器檢測。示差檢測器是基于連續(xù)測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高。在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。

5、電化學(xué)檢測器

電化學(xué)檢測器（electrochemical detector， ECD）屬選擇性檢測器，主要有電導(dǎo)檢測器、安培檢測器、介電常數(shù)檢測器和電位測定檢測器等，可檢測具有電活性的化合物。電導(dǎo)、電位等檢測器已在離子色譜中得到了廣泛應(yīng)用；介電常數(shù)檢測器性能類似于示差折光檢測器；安培檢測器可檢測氧化性物質(zhì)，適用范圍很寬。

電化學(xué)探測器的優(yōu)點：

①靈敏度高，檢測量一般為ng級，可以達(dá)到pg級。

②選擇性好，可測定大量非電活性物質(zhì)中極痕量電活性物質(zhì)；

③線性范圍寬，通常為4～5個數(shù)量級；

④設(shè)備簡單，成本較低；

⑤易于自動操作。

6、化學(xué)發(fā)光檢測器

化學(xué)發(fā)光檢測器（Chemiluminescence detector， CD）是近年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏的新型檢測器，具有設(shè)備簡單、價格低廉、線性范圍寬等優(yōu)點。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，就發(fā)射出光子。由于物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自化學(xué)反應(yīng)，故叫作化學(xué)發(fā)光。當(dāng)分離組分從色譜柱中洗脫出來后，立即與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)發(fā)光試劑混合，引起化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)產(chǎn)生輻射，其光強度與該物質(zhì)的濃度成正比。

這種檢測器不需要光源，也不需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，只要有恒流泵，將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，就可進(jìn)行檢測。這種檢測器的最小檢出量可達(dá)10～12g。

7、蒸發(fā)光散射檢測器

蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light—scattering detector，ELSD)是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的新型通用型質(zhì)量檢測器，它適用于檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等，并在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物。對各物質(zhì)有幾乎相同的響應(yīng)，但是其靈敏度比較低，尤其是有紫外吸收的組分。此外流動相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽等。它的通用檢測原理克服了常見于HPLC傳統(tǒng)檢測方法的不足，已越來越多地應(yīng)用于HPLC、超臨界色譜和逆流色譜中。不同于紫外和熒光檢測器，ELSD的響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。

（1）ELSD檢測原理

ELSD運行有三個過程：第一是霧化過程，用惰性氣體或凈化空氣將色譜柱流出物霧化；第二是蒸發(fā)過程，在一個加熱管(漂移管)中將流動相揮發(fā)；第三是檢測過程，測定留下來的樣品顆粒的光散射。所有商品ELSD都由一種或兩種模式完成這三個過程。模式A的操作是全部柱流出物(氣溶膠)都進(jìn)入直的漂移管，讓流動相在其中蒸發(fā)，模式B中是將氣溶膠通過一個彎管，在此管中大的顆粒沉積下來流入廢氣管，其余的小顆粒進(jìn)入螺旋狀的漂移管，在上述兩種模式中，樣品顆粒均進(jìn)入光管，使激光發(fā)生散射而得以檢測。

（2）ELSD檢測的優(yōu)點及缺點

優(yōu)點：

①具有較好的通用性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測；

②在相同色譜條件下，物理性質(zhì)相似的物質(zhì)可給出一致的響應(yīng)；

③能與梯度洗脫方式相容;

④靈敏度高于示差折光檢測器、紫外末端吸收檢測法。

⑤在ELSD上開發(fā)的實驗方法移植到質(zhì)譜上則無需修改。

ELSD檢測的不足之處主要是：

①靈敏度不夠理想；

②流動相的選擇受限；

③某些樣品線性范圍較窄等。

（3）影響ELSD檢測性能的基本因素

①操作模式選擇，選擇合適的操作模式可提高方法的靈敏度，操作模式的選擇取決于樣品的揮發(fā)性、流動相的組成及其流速。

②流動相組成及流速選擇，流動相的揮發(fā)性越好，方法的靈敏度越高。流動相的流速越低，相應(yīng)的信號越強。

③漂移管溫度對基線水平和噪音的影響并無明顯規(guī)律性。最優(yōu)溫度應(yīng)為在流動相基本揮發(fā)基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度。

④載氣流速是影響檢測性能的一個很重要因素。最優(yōu)載氣流速應(yīng)是在可接受噪音的基礎(chǔ)上(例如0.5mV)，產(chǎn)生最大檢測響應(yīng)值時的最低流速。

（4）ELSD檢測時的數(shù)據(jù)處理模式

ELSD檢測最常采用的數(shù)學(xué)模型是lgy=algx+b (y為響應(yīng)值，x為進(jìn)樣量或樣品濃度，a、b為回歸常數(shù))，也有采用二次曲線模型的(y=ax2+bx+c)。由于響應(yīng)值(y)與進(jìn)樣量(x)之間并非線性關(guān)系，故其數(shù)據(jù)處理不同于紫外檢測方法。ELSD測定已知物質(zhì)的含量時，一般應(yīng)用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線法而非外標(biāo)法，因為校正線性方程的截距并不為零。新藥基準(zhǔn)品的建立，除了對照品為另外一種含量已知、結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)外，數(shù)據(jù)處理方式同上相似。ELSD測定物質(zhì)純度時，由于響應(yīng)值與進(jìn)樣量間并非線性關(guān)系，多通過繪制其中的一種或數(shù)種物質(zhì)的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線來加以校正。多組分物質(zhì)的分析，除了隨行校正曲線的線性范圍有所區(qū)別外，數(shù)據(jù)處理同上類似。盡管存在一些不足之處，但是ELSD作為一種新型的通用型質(zhì)量檢測器，具有許多獨特的優(yōu)勢，例如它的通用性，響應(yīng)因子的一致性以及與梯度洗脫相容等，將在無特征紫外吸收物質(zhì)的分析方面發(fā)揮越來越重要的作用。

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