在實(shí)驗(yàn)的過程中經(jīng)常會(huì)遇到保留時(shí)間不穩(wěn)定的問題，我們也總接觸到相關(guān)問題的技術(shù)咨詢。我們的技術(shù)工程師深知大家的痛點(diǎn)，特根據(jù)大家的反饋，梳理了一個(gè)從發(fā)現(xiàn)問題到處理問題的解決思路。以后再遇到保留時(shí)間不穩(wěn)定的問題，就可以輕松搞定啦。

保留時(shí)間不穩(wěn)定，會(huì)是什么問題？

首先要找出變化的模式，

這個(gè)會(huì)幫助我們找到很多潛在的原因。

#1

保留時(shí)間在同一天變化大，

同一瓶流動(dòng)相，同一根色譜柱，同一臺(tái)儀器

1）首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來檢測(cè)流速（設(shè)置儀器流速1mL/min，用10ml量筒收集流出液10分鐘，應(yīng)該得到液體約10ml±0.5ml，量筒有誤差，使用的試劑與儀器廠家標(biāo)定泵流速時(shí)試劑不一樣，最終體積也有些差異，如果超過這個(gè)范圍，再分開通道檢測(cè)，以找到流速不正確的原因，并排除）；

2）檢查流動(dòng)相組成是否變化，可以在流動(dòng)相中加入跟蹤劑來觀察基線的變化，例如：反相條件，UV檢測(cè)器，在有機(jī)相中加入0.1%丙酮，監(jiān)測(cè)254nm下的基線變化，還有一種方法人工配制流動(dòng)相，然后通過混合器，這時(shí)候保留時(shí)間穩(wěn)定了，不再波動(dòng)，那就是混合器工作不正常，或者混合不均勻，進(jìn)行排除。

#2

保留時(shí)間一天之內(nèi)正常，不同天數(shù)之間變化

1）儀器本身不太可能有問題，可能是流動(dòng)相的組成變化引起的，在反相色譜中，保留因子k和流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑的體積含量成指數(shù)關(guān)系，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果有機(jī)溶劑含量誤差在1%，那保留時(shí)間的變化在5%-15%之間，大部分變化在10%左右，意味著用稱量有機(jī)溶劑的方式配置流動(dòng)相能得到更穩(wěn)定的保留時(shí)間；

2）流動(dòng)相的脫氣方式也可能導(dǎo)致，最好的脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右，非真空條件下超聲脫氣5分鐘，這樣會(huì)最大程度的減少溶劑的揮發(fā)，還有一種方法是流動(dòng)相中通過氦氣，流動(dòng)相被氦氣平衡后，氦氣流立刻關(guān)閉，避免氦氣帶走溶劑蒸汽，而導(dǎo)致溶劑組成改變；

3）流動(dòng)相的抽濾方式，通常情況下，如果我們使用有機(jī)溶劑和水相混合流動(dòng)相時(shí)，會(huì)先將流動(dòng)相配置混勻好后，再進(jìn)行抽濾，這樣的好處是流動(dòng)相混合更均勻，但是對(duì)于流動(dòng)相中沸點(diǎn)較低的部分，在抽濾過程中會(huì)損失更大，導(dǎo)致流動(dòng)相溶劑組成改變，建議有機(jī)相和水相分開抽濾，再進(jìn)行混合，超聲脫氣；

4）檢測(cè)目標(biāo)物是離子狀態(tài)或者離子化的，那么控制流動(dòng)相的pH就非常重要，就算是0.1單位pH的變化都有可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移10%左右，所以準(zhǔn)確稱量pH值并保證pH儀被很好的校正了，在反相色譜柱中，隨著pH值的升高，酸的保留會(huì)減少，堿的保留會(huì)增加。

反相色譜中，分離離子或離子化的樣品，保留時(shí)間會(huì)受到正確緩沖溶液的離子強(qiáng)度的影響，但影響會(huì)很小，可以不計(jì)，典型狀況是緩沖鹽的摩爾數(shù)改變20%，保留時(shí)間的變化是1%，緩沖鹽的組成通常是稱量的，那么大的誤差是不會(huì)發(fā)生的。

#3

保留時(shí)間漂移

還有影響保留時(shí)間的一個(gè)重要問題就是保留時(shí)間漂移（一直延長(zhǎng)或一直縮短）。

1）大部分工作者認(rèn)為漂移是平衡的問題，如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜，這是最有可能的原因，使用半飽和流動(dòng)相改善。反相色譜中，平衡通常會(huì)很快，5-10個(gè)柱體積的流動(dòng)相通常就足夠平衡了，但不全是如此，典型的就是離子對(duì)色譜中，使用離子對(duì)試劑平衡色譜柱，由于離子對(duì)試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料表面，表面濃度在0.5-2μmol/m²，1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對(duì)試劑進(jìn)行完全的柱平衡，流動(dòng)相濃度為2mmol時(shí)，那需要1L流動(dòng)相進(jìn)行平衡，這個(gè)雖然是極端條件，但是用幾百毫升的流動(dòng)相去平衡色譜柱也是正常的，因此離子對(duì)色譜中，使用了有機(jī)溶劑清除了離子對(duì)試劑，這樣第二天需要更長(zhǎng)的時(shí)間平衡色譜柱。這兩個(gè)現(xiàn)象都是流動(dòng)相中有低濃度的強(qiáng)吸附試劑導(dǎo)致的，這是保留時(shí)間漂移最常見的原因，也還有別的原因。

2）樣品中含有強(qiáng)吸附劑，在重復(fù)進(jìn)樣中會(huì)慢慢累積，從而改變色譜柱的化學(xué)性質(zhì)，如：藥品的賦形劑。可以通過觀察保留時(shí)間變化的速率來得知雜質(zhì)是從流動(dòng)相中引入還是樣品中引入。實(shí)驗(yàn)如下：

●進(jìn)樣幾次，如：進(jìn)樣四次，共使用了1個(gè)小時(shí)；

●走相同量的流動(dòng)相，不進(jìn)樣；

●重復(fù)第一步；

●做一個(gè)關(guān)系圖；

保留時(shí)間：▲對(duì)時(shí)間的關(guān)系

▲對(duì)進(jìn)樣次數(shù)的關(guān)系

如果第一個(gè)圖得到一條平滑的曲線，那么流動(dòng)相是引入雜質(zhì)的原因，如果第二個(gè)圖得到一條平滑的曲線，那么雜質(zhì)的來源是樣品。

3）鍵合相水解，色譜柱制造商會(huì)制定一個(gè)pH范圍，超出范圍可能導(dǎo)致鍵合相不穩(wěn)定，然而，很多情況下使用者不得不在接近這個(gè)pH極限，但是并沒有一個(gè)明顯的分界線，因?yàn)樗膺€取決于其他因素，如：溫度，有機(jī)溶劑，緩沖鹽的濃度和種類，樣品的化學(xué)性質(zhì)等，因此這個(gè)水解也可能發(fā)生在這個(gè)pH范圍內(nèi)。要保存固定相的水解穩(wěn)定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低溫下。等度條件穩(wěn)定性優(yōu)于梯度條件，在等度條件下發(fā)生水解的過程中，鍵合相通常會(huì)發(fā)生自我吸附，并達(dá)成一種區(qū)域平衡，在使用高濃度的有機(jī)溶劑時(shí)，在梯度時(shí)或者沖洗色譜柱時(shí)，這種平衡會(huì)被打破，鍵合相被沖出色譜柱。

4）溫度的變化，如果樣品是自動(dòng)分析過夜或者過了周末，那保留時(shí)間的漂移可能和實(shí)驗(yàn)室的溫度變化有關(guān)，在很多地方，室溫的設(shè)置在晚上或者周末是不一樣的，一般來講，1℃的變化導(dǎo)致保留時(shí)間的漂移大約在1%到2%。這個(gè)可以聯(lián)系最后一個(gè)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移的原因--柱壓的增加，柱壓的異常升高，表明色譜柱被污染，僅僅是篩板被堵塞就可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，這是因?yàn)?，為了使流?dòng)相通過篩板，需要額外的壓力來促使流動(dòng)相通過篩板，這會(huì)使流動(dòng)相在摩擦的過程中受熱，從而導(dǎo)致保留時(shí)間的漂移。

5）反相色譜鍵合相發(fā)生了“相塌陷”，由于流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例太少，高鍵合覆蓋率、“完全封端”的C18沒有很好的被流動(dòng)相浸潤(rùn)，這會(huì)使得流動(dòng)相和固定相沒有很好的接觸，造成鍵合相卷曲，固定相之間相互吸附，從而導(dǎo)致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少，使得保留時(shí)間逐漸變短。這時(shí)候立即用一定量的有機(jī)溶劑（建議40%乙腈水）沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復(fù)，這種現(xiàn)象在短鏈烷烴結(jié)合，未封尾的反相鍵合相上則很少發(fā)生，或者是不發(fā)生。

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