氣相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用很廣泛，其方法建立與驗證對藥物分析而言是非常重要的，今天小集就和大家聊一聊如何進(jìn)行氣相色譜的方法建立與方法驗證。

氣相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用包括藥物的定性、含量測定、雜質(zhì)檢查(有關(guān)物質(zhì)檢查)、農(nóng)藥殘留、殘留溶劑及微量水分測定、藥物中間體的監(jiān)控(反應(yīng)程度的監(jiān)控、合成路線的優(yōu)化)、中藥成分研究、制劑分析、體內(nèi)藥物分析及臨床診斷等方面。

其方法建立的一般步驟為首先確定樣品預(yù)處理方法；然后優(yōu)化分離條件，直到達(dá)到滿意的分離結(jié)果；最后建立數(shù)據(jù)處理的方法，包括定性鑒定和定量測定。根據(jù)不同的目的，對建立的方法進(jìn)行驗證。

01.樣品的來源和預(yù)處理方法

GC（氣相色譜儀）能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校疫€要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機(jī)鹽），可能會損壞色譜柱的組分。

針對一個未知樣品時，根據(jù)其來源與可能含有的組分，確定樣品的沸點范圍。如能確定直接進(jìn)樣分析，只要找一種合適的溶劑即可，如丙酮、己烷、三氯甲烷、苯等都是GC常用的溶劑。使用毛細(xì)管GC分析時，應(yīng)注意樣品濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品濃度為mg/ml級或更低。

如果樣品中有不能用GC直接分析的組分或樣品濃度太低，就必須進(jìn)行必要的預(yù)處理，包括采用一些預(yù)分離手段，如各種萃取技術(shù)、濃縮方法、提純方法等。

02.確定儀器配置

所謂儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進(jìn)樣裝置、什么載氣、什么色譜柱以及什么檢測器。

一般應(yīng)首先確定檢測器類型。碳?xì)浠衔锍＿x擇FID檢測器，含電負(fù)性基團(tuán)（F、Cl等）較多且碳?xì)浜枯^少的物質(zhì)易選擇ECD檢測器；對檢測靈敏度要求不高，或含有非碳?xì)浠衔锝M分時，可選擇TCD檢測器；對于含硫、磷的樣品可選擇FPD檢測器。

對于液體樣品可選擇隔膜墊進(jìn)樣方式，氣體樣品可采用六通閥或吸附熱解析進(jìn)樣方法，一般色譜僅配置隔膜墊進(jìn)樣方式，所以氣體樣品可采用吸附-溶劑解析-隔膜墊進(jìn)樣的方式進(jìn)行分析。

根據(jù)待測組分性質(zhì)選擇適合的色譜柱，一般遵循相似相容規(guī)律。分離非極性物質(zhì)時選擇非極性色譜柱，分離極性物質(zhì)時選擇極性色譜柱。色譜柱確定后，根據(jù)樣本中待測組分的分配系數(shù)的差值情況，確定色譜柱工作溫度，簡單體系采用等溫方式，分配系數(shù)相差較大的復(fù)雜體系采用程序升溫方式進(jìn)行分析。

常用的載氣有氫氣、氮?dú)?、氦氣等。氫氣、氦氣的分子量較小常作為填充柱色譜的載氣；氮?dú)獾姆肿恿枯^大，常作為毛細(xì)管氣相色譜的載氣；氣相色譜質(zhì)譜用氦氣作為載氣。

03.確定初始操作條件

當(dāng)樣品準(zhǔn)備好，且儀器配置確定之后，就可開始進(jìn)行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進(jìn)樣量、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進(jìn)樣量要根據(jù)樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。

樣品濃度不超過10mg/mL時填充柱的進(jìn)樣量通常為1-5uL，而對于毛細(xì)管柱，若分流比為50：1時，進(jìn)樣量一般不超過2uL。進(jìn)樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進(jìn)樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點最高的組分的沸點，但要低于易分解溫度。

04.分離條件優(yōu)化

分離條件優(yōu)化目的就是要在最短的分析時間內(nèi)達(dá)到符合要求的分離結(jié)果。在改變柱溫和載氣流速也達(dá)不到基線分離的目的時，就應(yīng)更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關(guān)鍵。

05.定性分析

所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對于簡單的樣品，可通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標(biāo)準(zhǔn)樣品和實際樣品，根據(jù)保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數(shù)據(jù)是不夠的，雙柱或多柱保留指數(shù)定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同的色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。條件允許時可采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)定性。

被測物組分定性分析方法包括：

利用保留時間定性；

利用加入純物質(zhì)增加峰高法定性；

利用相對保留值定性；

利用碳數(shù)/沸點規(guī)律定性；

利用保留指數(shù)定性；

利用雙柱或多柱定性；

利用檢測器定性；

與其它方法結(jié)合定性。

06.定量分析

要確定用什么定量方法來測定待測組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法最簡單，但最不準(zhǔn)確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時該法才是可選擇的。

峰面積（峰高）百分比法是根據(jù)檢測器對待測物的響應(yīng)（峰高或峰面積）與待測物的量成正比的原理進(jìn)行定量的。因此必須準(zhǔn)確測定峰高h或峰面積A。

定量依據(jù)：

注:Mi– I組分的量；fi– I組分的校正因子；Ai–I組分的峰面積

1．峰面積A的測量

對稱峰：峰高h與半峰寬的積即

A=1.065×h×W1/2

不對稱峰：峰高與平均峰寬的積即

A=1/2×h×（W1/2+ W085）

自動求和（自動積分儀或色譜工作站）

直接給出A,H,W1/2

2. 定量校正因子

定量分析的依據(jù)是被測組分的量與響應(yīng)信號成正比，但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測器上產(chǎn)生的信號也不同，直接用響應(yīng)信號定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子，在計算組分的量時，必須將峰面積A進(jìn)行“校正”。

（1）絕對校正因子

wi=fi’Ai

式中wi為組分I的量，它可以是質(zhì)量，也可以是摩爾或體積（對氣體）；Ai為峰面積，f為換算系數(shù)，稱為定量校正因子。

定量校正因子定義為：單位峰面積的組分的量。檢測器靈敏度Si與定量校正因子有以下關(guān)系式：

fi’=1/Si

（2）相對校正因子fi

由于絕對校正因子fi與檢測器靈敏度有關(guān)，它即不易準(zhǔn)確測得（因為物質(zhì)量Wi不易準(zhǔn)確測量），因此定量分析中常用相對校正因子表示fi，即用一個物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)，用相對校正因子將所有待測物的峰面積校正成相對于這個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，使各組分的峰面積與其質(zhì)量的關(guān)系有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行折算。

歸一化法的前提是，試樣中所有組分產(chǎn)生信號并能檢出色譜峰。依據(jù)組分含量與峰面積成正比。此方法優(yōu)點是簡便、準(zhǔn)確，定量結(jié)果與進(jìn)樣量、重復(fù)性無關(guān)；色譜條件略有變化對結(jié)果幾乎無影響。缺點是所有組分必須在一定時間內(nèi)都出峰，必須已知所有組分的校正因子，不適合微量組分的測定。

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）以Ai對xi標(biāo)準(zhǔn)曲線。該法不需校正因子。但進(jìn)樣量和操作條件必須嚴(yán)格控制外標(biāo)法適用日常分析和大批量同類樣品分析。

內(nèi)標(biāo)法在配制的每個標(biāo)準(zhǔn)溶液中以及待測試樣中加一固定量為ms的內(nèi)標(biāo)物，以Ai/As對xi作圖，得內(nèi)標(biāo)法校正曲線（以抵消實驗條件和進(jìn)樣量變化）。對內(nèi)標(biāo)物的要求是：樣品中不含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；峰的位置在各待測組分之間或與之相近；穩(wěn)定、易得純品；與樣品能互溶但無化學(xué)反應(yīng)；內(nèi)標(biāo)物濃度恰當(dāng)，使其峰面積與待測組分相差不太大。

07.方法的驗證

所謂的方法驗證，就是要證明所開發(fā)方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等?？煽啃詣t包括定量的線性范圍、檢測限、方法回收率、重復(fù)性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度等。

下面就簡單討論其中幾個可靠性參數(shù)：

1、方法的線性范圍

即檢測器響應(yīng)值與樣品量(濃度)成正比的線性范圍，它主要由檢測器的特性所決定。原則上。這一線性范圍應(yīng)覆蓋樣品組分濃度整個變化范圍。線性范圍的確定通常是采用一系列(多于3個)不同濃度的樣品進(jìn)行分析，以峰面積(或峰高)對濃度進(jìn)行線性回歸。當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于0．99時，就可認(rèn)為足線性的，小于0．99時，就超出了線性范圍。一個好的GC定量方法，其線性范圍(以FID檢測器為例)可達(dá)10；，線性相關(guān)系數(shù)等于或大于0．9999。

2、方法的檢測限

檢測限(DL)是指方法可檢測到的最小樣品量(濃度)。一般的原則是按照3倍信噪比計算，即氣樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時，該樣品的濃度就被作為最小檢測限，與此對應(yīng)的該組分的進(jìn)樣量就叫做最小檢測量-此外。憶驗證定量方法時，還將10倍信噪比所對應(yīng)的樣品濃度叫做最小定量限，當(dāng)用于法規(guī)分析時，這一數(shù)據(jù)應(yīng)等于或低于法規(guī)方法所要求的實際樣品中待測組分的最低允許濃度。

檢測限的測定可用一個接近檢測限濃度的樣品進(jìn)行分析，據(jù)所得色譜峰的峰高來計算。設(shè)此時濃度為c、相應(yīng)的峰高為h(信號強(qiáng)度單位)、基線噪聲為N(與h的單位相同)，則檢測限可按下面公式計算：

c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h

噪聲的大小與儀器的性能，特別是檢測器及其電子電路的穩(wěn)定性直接相關(guān)，也與載氣的純度、色譜柱的性能及操作條件有關(guān)。噪聲的測定是在正常操作條件下，儀器穩(wěn)定時，將信號放大(降低衰減或放大縱坐標(biāo))來測量，一般是測定樣品出峰前后1min的基線噪聲。

作為分析方法，檢測限無疑是越低越好。為此，應(yīng)選擇靈敏度高的檢測器，使用高純度的載氣和輔助氣，同時要定期維護(hù)儀器，保持進(jìn)樣口和檢測器的清潔，保持色譜柱的性能。此外，仔細(xì)優(yōu)化分離條件、適當(dāng)加大進(jìn)樣量(如采用大體積進(jìn)樣技術(shù))也是降低檢測限的常用方法。

3、方法回收率

即方法測得的樣品組分濃度與原來樣品中實有濃度的比率。如果樣品未經(jīng)任何預(yù)處理，則回收率一般可不考慮。只有當(dāng)某些樣品組分被儀器系統(tǒng)不可逆吸附時，回收率才是需要考慮的問題。如果樣品經(jīng)過了預(yù)處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。

回收率可用下述簡單方法測定：配置一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其兩等分，其中一份按方法步驟進(jìn)行預(yù)處理，然后用GC分析。另一份則不經(jīng)頸處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測組分峰面積的比率乘以100即是該組分的回收率。有時實際樣品很復(fù)雜，特別是樣品基質(zhì)對預(yù)處理的回收率影響較大時，就必須用空白樣品基質(zhì)(確信不含待測物)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，比如測定廢水中有機(jī)農(nóng)藥殘留量時，就要采用不含農(nóng)藥的水作空白基質(zhì)，在其中加入已知量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行處理和分析。處理后測得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很顯然，回收率太低時會影響方法的檢測限。當(dāng)樣品處理過程較復(fù)雜時，應(yīng)分步測定回收率，最后針對回收率最低的步驟進(jìn)行方法改進(jìn)，以期提高整個方法的回收率。

4、方法重復(fù)性和重現(xiàn)性

重現(xiàn)性是指同一方法在不同時間、地點、不同型號儀器、不同操作人員使用寸所得結(jié)果的一致性。與此近似的另一個術(shù)語是重復(fù)性，常指同一個人在同一臺儀器上重復(fù)進(jìn)樣所得結(jié)果的一致性。事實上，二者常?；煊茫鄶?shù)人不做嚴(yán)格區(qū)分。但大多數(shù)歐洲學(xué)者會嚴(yán)格區(qū)分二者的不同。我們認(rèn)為對現(xiàn)代儀器來說，分析重復(fù)性是容易實現(xiàn)的，而重現(xiàn)性則是更重要的，也是方法驗證所必須考察的。重現(xiàn)性和重復(fù)性都用多次分析所得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示。

方法的重現(xiàn)性應(yīng)包括多次連續(xù)進(jìn)樣分析的重復(fù)性、不同時間(天與天之間)分析的重復(fù)性、不同型號儀器之間的重現(xiàn)性和不同實驗室之間的重現(xiàn)性。作為方法開發(fā)人員，首先應(yīng)測定重復(fù)性，即在相同條件下連續(xù)進(jìn)樣5—10次，統(tǒng)汁待測組分的保留時間和峰面積(或峰高)的RSD，一般要求保留時間的RSD不大于1％，峰面積的RSD不大于5%。文獻(xiàn)報道的最佳重復(fù)性數(shù)據(jù)為保留時間的RSD小于0.1%，峰面積的RSD小于1%。

如果樣品要經(jīng)過預(yù)處理，還應(yīng)測定同一樣品多次處理的重復(fù)性。即同一樣品取3—5份做平行處理，看最后測定結(jié)果的重復(fù)性。這一RSD值應(yīng)不大于5％。當(dāng)然，有些工業(yè)分析要求不大于10％即可。至于天與天之間的重現(xiàn)性也不應(yīng)大于10%。

當(dāng)上述重復(fù)性滿足要求后，說明該方法在你的實驗室是可靠的。要將此方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法推廣使用，還必須測定不同儀器、不同實驗室之間的重現(xiàn)性。當(dāng)這些重現(xiàn)性(RSD)都能滿足要求時。這一方法的可靠性就得到了較為滿意的驗證。

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